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ELISPOT檢測的高端操作

時間:2018-01-31 09:02:02

先聊一聊ELISPOT

ELISA想必大家都不陌生,提到ELISPOT,可能有很多童鞋還有些一知半解,今天想要和大家分享的是使用我們的智能顯微鏡對ELISPOT這類實驗的檢測和分析。

ELISPOT的大名是酶聯免疫斑點實驗(Enzyme linked immunospot assay),它的出現是基于酶聯免疫吸附實驗的廣泛發展,特別在免疫研究領域,在測定各種免疫應答相關的體液游離細胞因子(CK)和特異性抗體時,傳統的ELISA方法往往顯得力不從心。這是由于細胞因子分泌特性及檢測靈敏度所限,使用ELISA測定過CK小伙伴,你們一定懂得。因此在上世紀80年代,建立在細胞水平的檢測特異性細胞因子和抗體的ELISPOT技術應運而生。它最大的優勢在于:靈敏度超高!單細胞水平!可動態監測!并且可以實現熒光多標記測定同一細胞分泌的多種細胞因子。

ELISPOT銀染法的主要流程

再來談談IL-2

我們今天分享的主要測定目標是細胞因子家族的白介素2(cytokine interleukin 2 , IL-2),它是一種由淋巴細胞分泌的多效細胞調控因子。在不同的刺激因素下,IL-2能夠通過促進未成熟的T細胞向調節T細胞轉化,從而防止自身免疫性疾病的發生;另外IL-2在調控T細胞分化方面也有重要作用,發揮腫瘤監視的作用。

IL-2的分泌的信號調控

我們怎么檢測ELISPOT?

ELISPOT的板底材料發展經歷了普通塑料板、硝酸纖維素膜(NC膜)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)一直到最新的荷蘭U-Cytech公司的透明材質的板底。傳統的PVDF膜的ELISPOT板子往往需要采購特定的ELISPOT分析儀,造成一定的資源浪費,而使用透明板底的一大好處是可以采用倒置的熒光成像光路進行成像檢測,這樣就輪到好用強大的BioTek成像設備來大顯身手了。

今天這個案例里是采用銀染法ELISPOT檢測IL-2的單因子測定,前期流程中的細胞孵育及洗板過程都可以用此前文章中提到的MultifuloFX或CBM系統來完成,當然如果您不嫌累可以手動操作。ELISPOT的最終評定是需要通過對整個孔內的細胞斑點進行定量評估,因此需要用到自動化全孔拼接的功能:

上圖展示了加入和未加入Jurkat cells 及是否加入IL-2誘導化合物的成像結果,由于銀染法最終會在板底形成深色的物質,所以通過明場成像即可清晰檢測到斑點的形成。BioTek的Cytation及LHFX系列成像設備均帶有全自動X-Y全孔圖像掃描功能,設置程序后,可進行高通量成像。

我們如何分析ELISPOT?

由于ELISPOT是一種靈敏度極高的細胞因子檢測技術,所以配套的分析軟件也必須給力。首先,大部分ELISPOT在染色過程中會出現非特異性著色的斑點,在Gen5 image軟件對spot進行圈選的時候,可以通過我們的散點圖統計分析法,設門直接剔除直徑極小的非特異性著色斑點,高端操作有木有!

上圖展示了Gen5圖像分析軟件對一個孔內spot數量和直徑的散點圖統計分布,由于有效分泌IL-2的細胞產生的斑點一定是比正常的細胞直徑要大的,因此可以設定剔除閾值50微米,上圖中鼠標直接拖動,這部分選中的細胞就OUT了!高端,就是這么任性!

設定好目標參數后,我們就可以分析擬合細胞接種數量和半點計數的曲線了,上圖的細胞給予聯合激動劑50 ng/mL PMA,1 μg/mL Ionomycin,和 30 μg/mL PHA 處理24小時,每個點統計了8個副本,很大的工作量呢,不過反正我們有高端操作,編個程序就行了。

解鎖更高端的ELISPOT技能

細胞因子參與免疫應答的過程本身是一個動態的過程,由于大部分的ELISPOT檢測受到最終顯色方法限制,需要手動進行時間點動力學測定,現在BioTek的智能解決方案可以提供一套基于自動化的時間點的檢測流程,只需要CBM設備,即可實現不同時間點白介素分泌的自動化檢測。下圖可以看出,前兩個小時未檢測到任何spots,而在藥物刺激8~10小時候,spots的數量趨于穩定。

圖的細胞給予聯合激動劑50 ng/mL PMA,1 μg/mL Ionomycin,和 30 μg/mL PHA 處理,每個點統計了6個副本。


通過軟件的四參數擬合,最后可以得到IL-2的聯合激動曲線及使用Triptolide抑制劑的抑制曲線。

此外,更可以選擇新型的熒光ELISPOT的方法進行細胞水平的多因子測定,需要選擇熒光的成像模塊,而圖像分析也更加多樣化

因此,采用ELISPOT分析IL-2的分泌能夠具有更高的靈敏度,使用全自動的圖像采集設備,不僅可以獲得清晰的全孔圖片,還能夠后續通過多重圖像分析獲得精確的斑點定量,非常適合研究平臺和篩選平臺使用。

不知道小伙伴們是否Get以上高端操作呢?關注我們,后續精彩繼續。

文中涉及相關儀器及方法:

自動化洗板機

智能細胞培養裝置

自動化成像系統

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