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免疫組化全攻略1:新手必讀

時間:2018-10-11 14:49:44

從技術上講,IHC的原理很簡單。首先固定樣品,以保留細胞完整性,之后與封閉液共同孵育,避免抗體的非特異結合。隨后將樣品先后與一抗和二抗孵育,并通過顯微鏡分析觀察信號。然而,這并不意味著實驗很好做。如何設計一個成功的IHC/ICC實驗,請看免疫組化全攻略。

在上世紀30年代,免疫組織化學(Immunohistochemistry,簡稱IHC)的原理就已經為人所知,但直到1942年,第一個IHC研究成果才正式發表。這也被譽為免疫熒光技術的里程碑。哈佛大學醫學院的Albert Coons在《免疫學雜志》上發表文章,利用FITC標記的抗體來鑒定感染組織中的肺炎球菌抗原。1自那以后,組織固定方法、檢測標記和顯微鏡都在不斷改進,讓免疫組化成為診斷和研究中的一個必備工具。

在病理科,利用特異的腫瘤標志物,醫生通過IHC診斷腫瘤是良性還是惡性,確定腫瘤的分期和分級,并確定細胞類型和轉移的來源,以便找到原發腫瘤的位置。同樣,IHC也能用于藥物開發,通過檢測疾病靶點的上調或下調來判斷藥物療效。

免疫組化指的是根據抗體與抗原特異結合的原理來檢測組織切片中的抗原(如蛋白)。immuno的詞根來自操作中所使用的抗體,而histo意味著組織。另一種類似的技術是免疫細胞化學(Immunocytochemistry,簡稱ICC)。這兩個詞大家經常混著用,看著好像差不多,但實際上還是有點區別。這里順便說說。

IHC vs. ICC

對于IHC,組織是來自患者或動物,經過冷凍或石蠟包埋。將這些組織制成約4μm厚的切片,封片后再處理。通過這種方法,研究人員可觀察細胞組分的定位,同時維持周圍組織的原先結構。

對于ICC,大部分細胞外基質及其他基質組分被去除,只剩下整個細胞來染色。ICC的來源可以是細胞懸液,來自患者或動物(如血涂片、拭子等),或在實驗室中進行的組織培養細胞系。

除了生物學來源,IHC和ICC在樣品處理的程度上也有所不同。ICC需要透化,要么通過固定過程,要么是單獨的透化步驟,這樣抗體才能與細胞內的靶點相結合。而IHC可能不要單獨的透化步驟,這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的IHC切片必須進一步處理,才能進行抗體染色。一旦處理好樣品,IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。當然,就染色而言,根據所使用的抗體來優化還是少不了的。

設計一個成功的IHC/ICC實驗

從技術上講,IHC的原理很簡單。首先固定樣品,以保留細胞完整性,之后與封閉液共同孵育,避免抗體的非特異結合。隨后將樣品先后與一抗和二抗孵育,并通過顯微鏡分析觀察信號。

然而,這并不意味著實驗很好做。最大的挑戰在于如何確定最佳的實驗條件,讓每個抗原都產生強烈而特異的信號。如果是個高豐度蛋白,那么挺好辦,需要的固定時間短,封閉時間短,可以用熒光標記一抗直接檢測。但如果要檢測冰凍切片中的磷酸化蛋白呢?那可能需要抗原修復,外加放大檢測。

IHC/ICC實驗設計和優化的變量,如下表。

變量

因素

抗原

物種、表達水平、樣品類型 & 亞細胞定位

表位

取決于構象和翻譯后修飾

樣品類型

組織或細胞

樣品制備

組織:石蠟或冰凍

細胞:貼壁細胞或細胞懸液

適當對照

無一抗、同型對照、吸附對照、組織類型對照

固定方法

灌注或浸泡

固定劑

甲醛、醇類或丙酮

封閉液

正常血清、牛血清白蛋白(BSA)或脫脂奶粉

抗原修復

蛋白酶誘導的表位修復(PIER)或熱誘導的表位修復(HIER

檢測方法

直接或間接(有無放大)

一抗

單克隆或多克隆

二抗

物種和標記

標記方法

熒光或顯色

標記

熒光染料、DABAEC

復染劑

熒光:DAPI

顯色:蘇木精

封片劑

熒光:抗淬滅封片劑

顯色:水性封片劑

觀察&分析

熒光顯微鏡或標準的光學顯微鏡


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