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IHC全攻略2:如何制備樣品

時間:2018-10-11 14:56:46

對于每一項IHC/ICC研究,組織和細胞樣本的制備都不可掉以輕心。為了方便孵育,整個組織必須被切成超薄(5-10 μm)的切片,或切成小塊用于整體免疫組化(whole mount IHC)。對于ICC實驗,在開始染色步驟之前,細胞必須附著在顯微鏡載玻片或蓋玻片上。樣本制備也與固定方法密切相關,而固定方法又會受到檢測技術(熒光 vs 顯色)的影響。

在大部分情況下,某個實驗變量將決定樣本制備的最合適方法。例如,浸潤固定在甲醛中的組織必須石蠟包埋,并利用切片機切片。或者,為了檢測磷酸化依賴的表位,組織可能需要快速冷凍,因此在醇類固定之后就需要一個低溫箱來進行樣本切片。

石蠟包埋的組織

石蠟包埋為長期保存組織樣本提供了最佳選擇。組織在用石蠟包埋之前必須固定。固定可通過灌注或解剖后立即浸潤來實現,一般需要4-24小時。不建議固定組織24小時以上,因為固定過度可能導致抗原的遮蔽。如有必要,組織在固定后可轉移至酒精中,直至包埋過程。

因為石蠟與水是不混溶的,所以組織在加入熔化的固體石蠟前必須脫水。脫水是通過浸潤在濃度遞增的酒精中而實現的。這種方法逐步改變疏水性,讓細胞傷害最小化。脫水之后,組織與二甲苯共同孵育,以去除任何殘留的酒精。石蠟一般加熱到60?C進行包埋,隨后過夜硬化。之后利用切片機用鋒利的刀片將組織切成超薄的切片。切片在顯微鏡載玻片上干燥,并長時間室溫儲存。組織切片在開始IHC/ICC步驟之前必須再水化。石蠟是組織包埋的最便宜也是最常用的物質。不過,組織也可包埋在塑料中,凝固得更硬,并切成更薄的組織切片(1.5μm vs 5 μm)。

冰凍組織

冰凍組織樣本的好處之一是省去了石蠟包埋組織最初所需的固定步驟。在檢測翻譯后修飾如磷酸化時,快速冷凍特別有益。冰凍組織的制備可將組織浸潤在液氮或異戊烷中,或埋在干冰里。對于冰凍組織,在冷凍和切片之后進行一個短時間的固定。冰凍組織切片最常用醇類固定,這避免了修復甲醛交聯所遮蔽的表位的需要。冰凍組織在低溫箱中切片,切片在-80?C可儲存多達1年。

冰凍組織切片的處理時間比石蠟包埋切片要短一些。不過,冷凍對于組織的長期保存是不夠的,且細胞內冰晶的形成可能會負面影響亞細胞的細節。此外,冰凍切片通常比石蠟切片厚。這可能導致較低的顯微鏡分辨率以及差的組織形態學圖像。因為冰凍切片通常保留酶的活性,所以封閉可能影響IHC檢測的內源酶的活性也是特別重要的。

IHC樣本制備的比較


組織


石蠟包埋

冰凍

固定

包埋前

切片后

切片

切片機

低溫箱

儲存

在室溫下多年

-80?C一年

優勢

保留組織形態

保留酶和抗原的功能

劣勢

固定過度可能遮蔽表位

冰晶的形成可能負面影響組織結構


細胞樣本

在開展ICC研究時,首先必須將細胞附著在固體支持物上,如顯微鏡載玻片或蓋玻片。這對于貼壁細胞很簡單,它們可直接放置在6孔或24孔板底部的高級無菌蓋玻片上生長。將蓋玻片預包被一層帶電荷的聚合物(如多聚賴氨酸)和/或細胞外基質蛋白(如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白或膠原),可增強細胞附著。染色過程的所有步驟可在微孔板內的蓋玻片上開展,向每個孔中加入適當的溶液并移走溶液。懸浮細胞可通過Cytospin? 離心或與包被多聚賴氨酸的玻片孵育10分鐘而附著在玻片上。

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