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IHC全攻略4:一抗的選擇與優化

時間:2018-10-11 15:01:43

在設計IHC/ICC實驗時,一抗的選擇是相當重要的。IHC/ICC實驗的所有步驟都必須經過優化,以便觀察到特異染色,并盡可能減少非特異的背景染色。這包括開展預實驗,以確定每個一抗的適當孵育條件。抗原親和純化的多克隆抗體的稀釋度通常低于單克隆抗體,但這些值必須根據經驗確定。為了獲得可靠特異的信號,應采用交叉反應性極少的高質量抗體。

一抗孵育的起始條件


單克隆抗體

多克隆抗體

組織

5-25 μg/mL4 °C孵育過夜

1.7-15 μg/mL4 °C孵育過夜

細胞

5-25 μg/mL,室溫下1小時

1.7-15 μg/mL,室溫下1小時

優勢

單表位特異性

所需濃度較低

限制

易受表位遮蔽的影響

異質群體

選擇單克隆還是多克隆抗

單克隆和多克隆抗體的內在特征決定了它們用于IHC/ICC時的優勢和限制。單克隆抗體由單個B細胞克隆產生,代表了同質群體,能夠高親和力高特異性地與單個表位結合。這在檢測蛋白家族的某個成員時特別有用,因為蛋白家族有著高比例的氨基酸同源性。

抗體結合往往依賴于目標蛋白維持其天然的構想狀態。與其他蛋白的相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會影響抗體接近目的表位。多克隆抗體是異質的,可識別多個表位,因此它們較少受到蛋白構象變化的影響。一般而言,多克隆抗體在一定pH和鹽濃度范圍內也比單克隆抗體更為穩定。基于這些原因,多克隆抗體更常用于IHC/ICC實驗。

多克隆抗體的親和純化

多克隆抗血清是抗體混合物,它們由大量B細胞克隆產生。組成多克隆抗血清的抗體以不同的特異性和親和力與目標表位結合,也與不相關的目標分子交叉反應(非特異相互作用)。為了富集與目的抗原特異性和親和力最高的抗體,R&D Systems的多克隆抗體經過抗原親和純化。在此過程中,多克隆抗血清流過包含固定化抗原分子的親和柱。特異抗體被固定化抗原保留,而非特異抗體流過柱子,被丟棄。隨后從柱子上洗脫經抗原親和純化的抗體。抗原親和純化的抗體主要與目的抗原相互作用,降低了背景染色,與未純化抗體相比產生了更一致的結果。

一抗孵育的優化

一抗濃度、稀釋液、孵育時間和溫度都影響了染色質量。這些變量需要針對每個抗體和樣品來優化,以便實現特異染色和低背景。優化通常是保持孵育時間和溫度不變,而改變抗體濃度,以確定何時獲得最佳信號和低背景噪音。例如,如果使用高親和力的抗體,那么相對較高的濃度可能需要較短的孵育時間。相反,較低的抗體濃度可能需要較長的孵育時間。人們通常采用較長的孵育時間,以確保抗體完全滲透到體視學技術所用的組織切片。為了促進特異染色,較長時間的孵育通常在低溫下開展(即4 °C vs 室溫)。

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