產品中心

招聘信息

? 地址:長春市綠園區景陽大路3333號
     明翰國際1346室
? 電話:400-8637-939
     0431-86758518
     15943082551
? 郵箱:[email protected]

新產品研究您當前的位置: 首頁 > 新產品研究

IHC全攻略5:對照的重要性

時間:2018-10-11 15:04:22

適當的對照對于IHC/ICC結果的準確闡釋至關重要。令人滿意的IHC/ICC實驗設計可產生結果,說明抗原位于正確的組織、細胞類型或亞細胞定位。固定、封閉、抗體孵育和抗原修復步驟的優化將產生強烈而特異的信號。然而,有時實驗也會出現假象哦,蒙蔽了你的雙眼。因此,IHC/ICC實驗必須包含陽性和陰性對照。

此外,抗體特異性、實驗條件、組織類型之間生物學條件、甚至研究人員的差異都可能產生不一致的染色,導致不準確的結論。為了實現性能一致,詳細記錄是IHC/ICC研究的一個重要因素。在此,我們介紹了一些公認的對照,可支持您IHC/ICC結果的特異性。

內源組織背景對照

某些細胞和組織可能有著固有的生物學性質,產生背景染色,從而導致結果的誤讀。在一抗上樣之前,應利用熒光(適用于熒光標記)或明視場(適用于顯色標記)照明在顯微鏡下檢查細胞和組織,以確保組織本身沒有信號。例如,脂褐質是一種內源的自發熒光色素,可與陽性染色混淆。

無一抗對照

將組織與抗體稀釋液孵育,其中不包含一抗的對照通常也是必需的。之后與二抗和檢測試劑孵育。只用檢測試劑染色應該是可以忽略的,它不會掩蓋特異染色,也不會類似于特異染色的模式。

同型對照

在使用單克隆一抗時,可利用此對照。將樣品與抗體稀釋液孵育,并添加與一抗相同亞型(如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgM)和濃度的非免疫球蛋白。之后將樣品與二抗和檢測試劑孵育。這些步驟將確保特異染色所出現的不是由免疫球蛋白分子與樣品的非特異相互作用引起的。背景染色應該是可以忽略的,與特異染色不同。

吸附對照

為了證明抗體是與目的抗原特異結合,首先要將抗體與免疫原預孵育。這會使抗體失活,組織應該無染色或很少染色。抗原與抗體的混合物應以10:1(摩爾比)配制,并在4 °C預孵育過夜。隨后將預吸附的抗體與組織共同孵育,以取代一抗。將一抗產生的染色模式與預吸附抗體產生的相比較。

如果免疫原是肽段,那么吸附對照效果更好。不過,如果抗體是由整個蛋白產生的,則抗體與蛋白混合物的添加可能導致更高的非特異染色。盡管機理還不清楚,但有可能是預吸附所用的抗原本身與組織結合,產生非特異染色。因此,必須注意,使用整個蛋白的吸附對照不一定能驗證抗體與組織中蛋白結合的特異性。

大鼠背根神經節中的吸附對照。A. 利用anti-human phospho-MSK1親和純化過的多克隆抗體(貨號AF1036)對大鼠背根神經節冰凍切片中的磷酸化MSK1(S212)進行染色。B. 如果抗體用S212磷酸化免疫原預先吸附,則細胞核染色(箭頭所指)不見了。

組織類型對照

IHC/ICC實驗的其他對照包括使用已知表達(或不表達)目的表位的組織樣品。這種策略可提供有用的參考,也可使用在初步優化研究中。來自轉基因動物的組織特別有用,它們表達或不表達抗原。此外,不同物種的組織樣品也可包含在內,以支持抗體的物種特異性。

Western Blot有必要嗎?

人們常常開展Western blot實驗,以補充或支持IHC/ICC研究。不過,在變性過程中蛋白構象的變化可能產生誤導性的結果。對于某一特定抗體,Western blot與IHC/ICC研究之間的不一致可能只是反映出實驗條件的差異。由于多克隆抗體識別多個表位,故沒那么容易產生這種實驗假象。

新华爱彩网