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IHC全攻略7:預防非特異性染色

時間:2018-10-11 15:34:35

所有IHC/ICC研究都依賴特異的抗體-抗原表位結合,這是由疏水相互作用、氫鍵及其它分子間作用力來控制的。不過,相同的吸引力也可能引起非特異染色,即一抗與目的抗原表位之外的氨基酸結合。這是IHC/ICC實驗中經常存在的一個問題。我們的挑戰在于如何降低非特異相互作用,而不損害抗體-表位的結合。

非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用,抗體與組織之間的離子相互作用,以及與能夠影響IHC檢測系統的內源分子的相互作用。這些問題會產生高背景,以及無法在適當的細胞位置觀察目的抗原。這種類型的染色問題可通過用封閉劑來封閉非特異相互作用來解決。在將樣本與一抗共同孵育之前,可開展這些步驟。

預防非特異疏水相互作用

盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結合中起了重要作用,但這些力同樣能促進非特異結合。由于一些氨基酸的中性側鏈,大部分蛋白有著某種程度的疏水性。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白(BSA)共同孵育,是降低非特異疏水結合的常用步驟。正常血清類型的選擇對預防與一抗或二抗的相互作用,或預防與待染色組織/細胞的相互作用很重要。例如,在使用山羊來源的一抗時,不建議用山羊血清作為封閉劑。而是推薦與二抗的宿主動物相同的血清或來自不相關物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中。非離子去污劑如0.3% Triton X-100?或Tween 20?的添加也能降低非特異疏水相互作用。

預防非特異離子相互作用

如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷,那么離子相互作用可能導致非特異的背景染色。例如,非特異染色可能來自相反的羧基和氨基相互作用。范德華力、兩級分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強度能降低離子相互作用。不過,表位-抗體結合通常依賴于離子強度,因此這種方法也可能負面影響染色特異性。由于單克隆抗體的單表位特異性,與多克隆抗體相比,增加離子強度更可能損害其性能。

內源酶的干擾

顯色檢測法常使用一種結合的酶來觀察表位-抗體的相互作用。在使用這種檢測方法時,同一種酶的內源活性必須被封閉。例如,包含辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的操作步驟可能需要試劑來防止非特異信號。腎、肝或帶有紅細胞的血管區域等組織含有內源的過氧化物酶活性。由3-10% H2O2配制而成的過氧化物酶封閉液能用于防止內源的過氧化物酶切割底物。內源的堿性磷酸酶主要在腸、腎、淋巴及其它組織中發現,能被1 mM 左旋咪唑(Levamisole)封閉。堿性磷酸酶的腸道形式不受左旋咪唑影響,但能用1% 乙酸封閉。

內源的生物素干擾

鏈親和素與生物素化的一抗或二抗結合,是IHC/ICC實驗常用的另一種檢測系統。因此,在鏈親和素孵育之前,內源的生物素必須被封閉。內源的生物素在多個組織中發現,包括肝、腎、心臟、腦和肺。樣本與親和素(avidin)預先孵育,通常可封閉內源的生物素。接下來必須與生物素共同孵育,以封閉親和素分子上多余的生物素結合位點。在這些生物素/親和素封閉步驟之后,樣本才能與一抗孵育。

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