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IHC全攻略8:問題到底出在哪兒?

時間:2018-10-11 15:36:18

從技術上說,IHC和ICC實驗并不難,然而,每個實驗又有那么多的變量需要鑒定和優化。若運氣不佳,實驗結果不太好,那么我們可能要做個troubleshooting,看看問題到底出在哪兒。下表就列出了IHC/ICC實驗的常見問題,以及相應的對策。

問題1:缺乏染色

可能原因

對策

缺乏抗原

通過原位雜交檢查蛋白表達。

因儲存不當,抗體不起作用

按照說明書上的說明儲存。一般來說,將抗體分裝成小份,足夠單次實驗使用。將這些抗體儲存在手動除霜的冰箱中(-20 to -70 °C),避免反復凍融。

一抗或二抗失活

獨立檢測報告系統,以評估試劑是否有用。

組織固定不足

嘗試增加固定時間或換一種固定劑。

組織過度固定

減少浸潤或固定后步驟的持續時間。如果浸潤固定無法避免,那么通過抗原修復試劑,讓抗原不被遮蔽。

一抗與二抗不兼容

使用能與一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗來自兔子,那么就使用抗兔的二抗。

在固定或包埋過程中表位已改變

通過各種抗原修復技術嘗試恢復免疫反應性。

58°C或以下包埋組織。

抗原修復不起作用

增加處理時間或改變處理溶液。

試劑遺漏或順序不對

重復染色過程,確認使用了正確的試劑,并以正確順序添加。

問題2:高背景

可能原因

對策

一抗或二抗的濃度高

滴定抗體,以確定促進一抗和二抗的特異反應所需的最佳濃度。。

組織中抗體和蛋白的疏水相互作用

降低抗體稀釋液的離子強度(特別是單克隆抗體)。

一抗或二抗與組織的非特異結合

在一抗孵育之前采用封閉步驟(通常使用1% BSA10% 正常驢血清)。脫脂奶粉也是個選擇。

二抗的非特異結合

使用交叉反應性IgG被去除的抗體。

組織變干

在染色過程中避免讓組織變干。

離子相互作用引起的背景

提高稀釋液的離子強度。

問題3:細胞/組織形態被破壞

可能原因

對策

抗原修復方法太過劇烈

根據經驗確定實驗條件,既能保留組織形態,又能恢復抗原的免疫反應性

組織切片從玻片上脫落

增加固定時間。根據經驗確定另一種固定劑。

組織切片撕裂或折疊。切片下有氣泡

重新切片,或在分析結果時忽略受損區域。

組織形態的分辨率差

切出更薄的組織切片。冰晶可能會破壞冰凍切片的形態。

固定不足在染色過程中會導致組織或細胞受損

延長固定時間。提高固定劑/組織的比例。切出更小的組織,以便更徹底的浸潤。

組織自溶導致壞死碎片的染色

延長固定時間、比例。考慮使用交聯的固定劑。

問題4:染色不當

可能原因

對策

固定方法不當

嘗試另一種固定劑,或延長固定時間。

抗原修復可能不當

嘗試另一種抗原修復條件。

抗原的靜電荷被改變

嘗試調整抗體稀釋液的pH或陽離子濃度。

固定拖延導致抗原擴散

快速固定組織。嘗試交聯固定劑,而不是有機固定劑。


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